Tyypin II transmembraaniset seriiniproteaasit rintasyövän ennusteen kuvaajina

Bisfosfonaattien kohdennettu käyttö rintasyövän liitännäishoitona

Johanna Tuomela | Tammi 2018 | Onkologia ja Hematologia |

Johanna Tuomela
dosentti
Solubiologia ja anatomia,
Turun yliopisto

Katri Selander
LT, solubiologian dosentti,
syöpätauteihin erikoistuva lääkäri
OYS, Syöpätautien
ja sädehoidon klinikka

Jouko Sandholm
FT, tutkimuskoordinaattori
Biotekniikan keskus,
Turun yliopisto ja Åbo Akademi

Kolmoisnegatiivista rintasyöpää sairastaville potilaille ei ole taudin molekyylipatologiaan perustuvaa täsmälääkettä. Tällaisia kasvaimia, jotka eivät ilmennä hormoni- tai HER2-reseptoreita, on noin viidesosa kaikista rintasyövistä. Kolmoisnegatiiviset kasvaimet edustavat huonoennusteisinta rintasyöpää, koska ne metastasoivat varhain ja mutatoituvat nopeasti. Tauti on kuitenkin erittäin heterogeeninen, ja osa potilaista paranee täysin perinteisillä syöpähoidoilla. Osalla potilaista aggressiivinen tauti sen sijaan johtaa nopeaan kuolemaan. Löysimme prekliinisissä tutkimuksissamme potilasryhmän, joka saattaisi erityisesti hyötyä bisfosfonaattihoidoista.

Bisfosfonaatteja on käytetty osteoporoosin ja syövän luuetäpesäkkeiden hoidossa jo vuosikymmeniä. Muutamia harvinaisia mutta hankalia sivuvaikutuksia, kuten leukaluun osteonekroosia, lukuun ottamatta bisfosfonaatit ovat yleensä hyvin siedettyjä lääkkeitä.1 Bisfosfonaatit estävät luun hajotusta haittaamalla luuta syövien osteoklastien toimintaa ja sitä kautta nämä lääkkeet vähentävät syövän luustossa aiheuttamia päätetapahtumia, kuten murtumia, kipua ja hyperkalsemiaa. Osteoklastien muodostumista ja toimintaa estävä vasta-aine, denosumabi, on kuitenkin viime vuosina syrjäyttänyt bisfosfonaattien käytön onkologiassa pääasiassa helppokäyttöisyytensä vuoksi.2 Viimeaikaiset tutkimukset kuitenkin osoittavat, että bisfosfonaateilla saattaa olla luustovaikutuksen lisäksi myös suoria, syövän kasvua estäviä vaikutuksia. Erityisesti rintasyöpää sairastavat postmenopausaaliset naiset voivat hyötyä merkittävästi liitännäisbisfosfonaattihoidosta. Äskettäin julkaistussa meta-analyysissä (n = 18 206 potilasta) osoitettiin, että bisfosfonaattilääkitys rintasyövän liitännäishoitona ehkäisi luustometastasointia jopa 28 %, ja rintasyöpäkuolleisuutta 18 %.3 Vaikutukset olivat kasvaimen reseptoristatuksesta, imusolmukelevinneisyydestä, käytetystä bisfosfonaatista tai muusta hoidosta riippumattomia.3 Suotuisat vaikutukset havaittiin nimenomaan postmenopausaalisilla naisilla. Euroopan onkologiyhdistys piti näitä tuloksia kuitenkin niin merkittävinä, että se on vuoden 2016 alusta lähtien suositellut bisfosfonaattien lisäämistä kaikkien postmenopausaalisten rintasyöpäpotilaiden liitännäishoidoksi.4

Liitännäishoitona annettavien bisfosfonaattien aiheuttama absoluuttinen hyöty on kuitenkin melko pieni. Jotta yhden potilaan luustolevinneisyys estyisi, pitää bisfosfonaatteja antaa 45 naiselle. Vastaavasti, jotta yksi rintasyöpäkuolema estyisi, pitää 30 potilasta liitännäishoitaa.3 Bisfosfonaattien käyttö olisi tehokkaampaa, mikäli lääkkeestä hyötyminen voitaisiin ennustaa potilaan verestä tai kasvaimesta mitattavalla biomarkkerilla. Toistaiseksi tällaisia biomarkkereita ei ole kliinisessä käytössä.5

Tollin kaltainen reseptori 9 ennusteellisena biomarkkerina
Tollin kaltainen reseptori 9 (TLR9) on elimistön sisäsyntyiseen immuunipuolustusjärjestelmään kuuluva reseptoriproteiini, joka tunnistaa soluissa mikrobiperäistä ja omista soluista esim. solukuoleman yhteydessä vapautunutta DNA:ta.6 TLR9:n stimulointi DNA:lla johtaa soluissa nopeaan tulehdusreaktioon ja tulehdusvälittäjäaineiden, kuten IL-6:n ja TNFα:n lisääntyneeseen tuottoon. Tällaisen tulehdusreaktion tarkoitus on eliminoida elimistöä uhkaava mikrobi-infektio, ja se johtaa myös adaptiivisen immuunipuolustuksen aktivoitumiseen.7

Immuunisolujen lisäksi TLR9-proteiinia ilmennetään myös useissa syöpäkudoksissa. Osoitimme ensimmäisenä, että myös rintasyöpäsolut ja -kudokset ilmentävät TLR9-proteiinia.8 Osoitimme myös, että synteettiset TLR9-agonistit, bakteerin DNA:ta muistuttavat, CpG-sekvenssin sisältävät DNA-molekyylit lisäävät TLR9-proteiinia ilmentävien syöpäsolujen invaasiota in vitro.9 Tämän havainnon perusteella lähdimme tutkimaan TLR9:n osuutta rintasyövän patofysiologiassa. Lähtökohtainen hypoteesimme oli, että korkea TLR9:n ekspressio ennustaa syövän metastasointia ja huonoa prognoosia. Testasimme hypoteesia vertaamalla syöpäkudoksen TLR9-värjäytymisvoimakkuutta potilaiden rintasyöpäspesifiseen elossaoloaikaan sekä hormonireseptoripositiivista että kolmoisnegatiivista rintasyöpää sairastavilla potilailla. Yllätykseksemme ja vastoin oletustamme havaitsimme, että syöpäkudoksen matala TLR9:n ilmentymistaso on yhteydessä huonoon ennusteeseen, mutta ainoastaan kolmoisnegatiivista rintasyöpää sairastavilla naisilla (Kuva 1).10 Tämän tuloksen ovat vahvistaneet myöhemmin muut tutkimusryhmät,11 ja vastaava löydös on tehty myös munuais- ja haimasyövistä sekä sylkirauhasen mukoepidermoidikasvaimista.12-14

Kuten TLR9-ligandit, myös bisfosfonaatit aiheuttavat soluissa tulehdusväliaineiden lisääntynyttä tuottoa. Koska bisfosfonaattien ja TLR9-agonistien aikaansaamat tulehdusreaktiot muistuttavat toisiaan, mietimme, voisiko TLR9:n ilmentyminen vaikuttaa jotenkin siihen, miten solut reagoivat bisfosfonaatteihin. Tätä testataksemme vertasimme bisfosfonaattien vaikutuksia eri rintasyöpäsolulinjoihin, joissa oli joko normaali tai siRNA-menetelmällä vaimennettu TLR9-taso. Huomasimme, että matalan TLR9-tason (TLR9 siRNA) syöpäsolulinjat ja kokeelliset kasvaimet olivat merkittävästi herkempiä bisfosfonaateille kuin vastaavat korkean TLR9-tason (kontrolli-siRNA) syöpäsolut (Kuva 2).15 Ilmiön solubiologinen mekanismi on vielä selvittämättä, mutta vaikutus oli samansuuntainen käytetystä bisfosfonaatista tai syöpäsolujen reseptoristatuksesta riippumatta. Paras vaste havaittiin käytettäessä tsoledronaattia kolmoisnegatiivisissa, matalan TLR9-tason rintasyöpäsoluissa.

Bisfosfonaattien annostelu nanopartikkelien avulla ohjaa lääkkeen kohteeseen
Bisfosfonaatit ovat molekyylirakenteeltaan pyrofosfaattianalogeja. Ne jaetaan sivuketjujensa rakenteen mukaan ns. ensimmäisen sukupolven pyrofosfaattia muistuttaviin bisfosfonaatteihin (esim. klodronaatti) ja uudempiin aminobisfosfonaatteihin, joista tsoledronaatti on tehokkain. Ensimmäisen sukupolven bisfosfonaattien vaikutus (osteoklasteissa ja syöpäsoluissa) johtuu myrkyllisen AppCCl2:n kerääntymisestä soluihin. Aminobisfosfonaatit puolestaan vaikuttavat ATP-analogi ApppI:n solunsisäisen kertymisen lisäksi inhiboimalla kolesterolisynteesissä tärkeää mevalonaattireittiä, jolloin soluille elintärkeiden pienten GTPaasien prenylaatio estyy ja solu ei pysty toimimaan tai kuolee (Kuva 3).16-18

Pyrofosfaattirakenteensa takia bisfosfonaatit sitoutuvat nopeasti ja tehokkaasti luun hyroksiapatiittiin ja siten vaikutusaika pehmytkudoskasvaimissa ja veressä on lyhyt. Olemme tutkineet mahdollisuutta annostella bisfosfonaatteja kohdennetusti kasvaimeen nanopartikkeleiden avulla. Teimme prekliinisen kokeen, jossa tsoledronaatti kohdennettiin kolmoisnegatiivisiin matalan TLR9-tason rintasyöpäkasvaimiin foolihapolla päällystettyjen silika-nanopartikkelien avulla. Verrattuna vapaaseen tsoledronaattiin tai tyhjiin nanopartikkeleihin tsoledronaatti-nanopartikkelit olivat kasvaimen kasvua estävinä lääkkeenä tehokkaampia.19

Yhteenveto

Tuumorin matala TLR9-ilmentymistaso on huonon ennusteen merkki kolmoisnegatiivista rintasyöpää sairastavilla potilailla. Yllättävästi matalan TLR9-ilmentymistason rintasyöpäsolut ovat merkittävästi herkempiä bisfosfonaattien suorille kasvunestovaikutuksille in vitro ja in vivo verrattuna paljon TLR9:ää ilmentäviin rintasyöpäsoluihin. Matalan TLR9-ilmentymistason herkkyys bisfosfonaateille on rintasyöpäsolujen hormonireseptoristatuksesta riippumatonta. Vaikka ilmiön solubiologista mekanismia ei tällä hetkellä tunneta, tuloksemme viittaavat siihen, että liitännäishoitona annetulla tsoledronaatilla voisi olla paras vaikutus ennusteeseen nimenomaan matalan TLR9-tason kolmoisnegatiivista rintasyöpää sairastavilla, postmenopausaalisilla naisilla. Tämä hypoteesi tulisi testata prospektiivisella kliinisellä tutkimuksella.

Sidonnaisuudet: Kirjoittajilla ei ole sidonnaisuuksia.

Lähteet

1. Van Acker HH, Anguille S, Willemen Y, Smits EL, Van Tendeloo VF. Bisphosphonates for cancer treatment: Mechanisms of action and lessons from clinical trials.Pharmacol Ther 2016 Feb;158:24-40. 2. Pittman K, Antill YC, Goldrick A, Goh J, de Boer RH. Denosumab: Prevention and management of hypocalcemia, osteonecrosis of the jaw and atypical fractures. Asia Pac J Clin Oncol 2017 Aug;13(4):266-276.  3. Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG). Adjuvant bisphosphonate treatment in early breast cancer: meta-analyses of individual patient data from randomised trials. Lancet 2015 Oct 3;386(10001):1353-1361.  4. Hadji P, Coleman RE, Wilson C, Powles TJ, Clézardin P, Aapro M, Costa L, Body JJ, Markopoulos C, Santini D, Diel I, Di Leo A, Cameron D, Dodwell D, Smith I, Gnant M, et al. Adjuvant bisphosphonates in early breast cancer: consensus guidance for clinical practice from a European Panel. Ann Oncol. 2016; 27(3):379-390. 5. Westbrook JA, Cairns DA, Peng J, Speirs V, Hanby AM, Holen I, Wood SL, Ottewell PD, Marshall H, Banks RE, Selby PJ, Coleman RE, Brown JE. CAPG and GIPC1: Breast Cancer Biomarkers for Bone Metastasis Development and Treatment. J Natl Cancer Inst 2016 Jan 12;108(4).  6. Tuomela J, Sandholm J, Kaakinen M, Patel A, Kauppila JH, Ilvesaro J, Chen D, Harris KW, Graves D, Selander KS. DNA from dead cancer cells induces TLR9-mediated invasion and inflammation in living cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2013; 142(3):477-487. 7. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino K, Wagner H, Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 2000; 408(6813):740-745. 8. Merrell MA, Ilvesaro JM, Lehtonen N, Sorsa T, Gehrs B, Rosenthal E, Chen D, Shackley B, Harris KW, Selander KS. Toll-like receptor 9 agonists promote cellular invasion by increasing matrix metalloproteinase activity. Mol Cancer Res 2006; 4(7):437-447. 9. Tuomela J, Sandholm J, Kaakinen M, Hayden K, Haapasaari K-M, Jukkola-Vuorinen A, Kauppila J, Lehenkari P, Harris KW, Graves D, Selander KS. Telomeric G-quadruplex-forming DNA fragments induce TLR9-mediated and LL-37-regulated invasion in breast cancer cells in vitro. Breast Cancer Res. Treat 2016; 155:261-71. 10. Tuomela J, Sandholm J, Karihtala P, Ilvesaro J, Vuopala KS, Kauppila JH, Kauppila S, Chen D, Pressey C, Härkönen P, Harris KW, Graves D, Auvinen PK, Soini Y, Jukkola-Vuorinen A, Selander KS. Low TLR9 expression defines an aggressive subtype of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2012; 135(2):481-493. 11. Meseure D, Vacher S, Drak Alsibai K, Trassard M, Nicolas A, Leclere R, Lerebours F, Guinebretiere JM, Marangoni E, Lidereau R, Bieche I. Biopathological Significance of TLR9 Expression in Cancer Cells and Tumor Microenvironment Across Invasive Breast Carcinomas Subtypes. Cancer Microenviron 2016; Dec;9(2-3):107-118. 12. Ronkainen H, Hirvikoski P, Kauppila S, Vuopala KS, Paavonen TK, Selander KS, Vaarala MH. Absent Toll-like receptor-9 expression predicts poor prognosis in renal cell carcinoma. J Exp Clin Cancer Res 2011; 30:84. 13. Korvala J, Harjula T, Siirilä K, Almangush A, Aro K, Mäkitie AA, Grénman R, Karttunen TJ, Leivo I, Kauppila JH, Salo T. Toll-like receptor 9 expression in mucoepidermoid salivary gland carcinoma may associate with good prognosis. J Oral Pathol Med 2014; 43(7):530-537. 14. Leppänen J, Helminen O, Huhta H, Kauppila JH, Isohookana J, Haapasaari KM, Lehenkari P, Saarnio J, Karttunen TJ. High toll-like receptor (TLR) 9 expression is associated with better prognosis in surgically treated pancreatic cancer patients. Virchows Arch 2017 Apr;470(4):401-410. 15. Sandholm J, Lehtimäki J, Ishizu T, Velu SE, Clark J, Härkönen P, Jukkola-Vuorinen A, Schrey A, Harris KW, Tuomela JM, Selander KS. Toll-like receptor 9 expression is associated with breast cancer sensitivity to the growth inhibitory effects of bisphosphonates in vitro and in vivo. Oncotarget 2016; 7(52):87373-87389. 16. Luckman SP, Hughes DE, Coxon FP, Graham R, Russell G, Rogers MJ. Nitrogen-containing bisphosphonates inhibit the mevalonate pathway and prevent post-translational prenylation of GTP-binding proteins, including Ras. J Bone Miner Res 1998; 13(4):581-589. 17. Virtanen SS, Väänänen HK, Härkönen PL, Lakkakorpi PT. Alendronate inhibits invasion of PC-3 prostate cancer cells by affecting the mevalonate pathway. Cancer Res 2002; 62(9):2708-2714. 18. Tuomela JM, Valta MP, Väänänen K, Härkönen PL. Alendronate decreases orthotopic PC-3 prostate tumor growth and metastasis to prostate-draining lymph nodes in nude mice. BMC Cancer 2008; 8:81. 19. Desai D, Zhang J, Sandholm J, Lehtimäki J, Grönroos T, Tuomela J, Rosenholm J. Lipid bilayer-gated mesoporous silica nanocarriers for tumor-targeted delivery of zoledronic acid in vivo. Mol Pharm 2017 14(9):3218-3227.